熒光顯微鏡原理及應(yīng)用

　　(一)熒光顯微鏡的原理和結(jié)構(gòu)特點 ：熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于細胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學(xué)成分等的研究。熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源 、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。熒光光源——般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個產(chǎn)生最強熒光的激發(fā)光波長 ，所以需加用激發(fā)濾片(一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片)，僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛，二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。

　　熒光顯微鏡就其光路來分有兩種：

　　1.透射式熒光顯微鏡: 激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標(biāo)本材料來激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上.這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點是低倍鏡時熒光強，而缺點是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱.所以對觀察較大的標(biāo)本材料較好。

　　2.落射式熒光顯微鏡這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個雙色束分離器，它與光鈾呈45。角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強。

　　熒光顯微鏡使用注意事項：

　　1、 嚴格按照熒光顯微鏡出場說明書要求進行操作，不要隨便改變程序。

　　2、 最好在暗室中進行檢驗。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5~15min，待光源發(fā)出強光并穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。

　　3、 防止紫外線對眼睛的傷害，再調(diào)整光源時，應(yīng)帶上防護眼睛。

　　4、 檢查時間以一次1-2hrs為宜，如果超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3~5min后，標(biāo)本熒光也明顯減弱;所以最多不要超過2~3hrs。

　　5、 熒光光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時，應(yīng)打開電扇或空調(diào)散熱降溫。換新燈泡應(yīng)從開始使用就記錄時間。等熄滅后欲在使用，待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。

　　6、 標(biāo)本染色后立即觀察，時間久了熒光會逐漸減弱。若將標(biāo)本保存在聚乙烯塑料袋中4度保存，可延緩熒光減弱時間。

　　7、 熒光強度的判斷標(biāo)準;一般分為四級，1： 無或可見微弱熒光，2：僅能見明確可見熒光，3：可見有明亮的熒光，4：可見耀眼的熒光。