聚丙烯酰胺凝膠電泳色譜儀是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質進行電泳分離,聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好、有彈性、透明、化學性質穩(wěn)定、對pH和溫度變化小、沒有吸附、電滲作用小等特點,是一種很好的支持介質。
一、聚丙烯胺凝膠聚合方式:
聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(CH2 = CH-CO-NH2,簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N′-甲叉雙丙烯酰胺(CH2 = CH-CO-NH-CO-CH = CH2,簡稱Bis)在催化劑過硫酸銨(AP)和加速劑N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀凝膠,凝膠孔徑大小由丙烯酰胺的濃度決定。
二、電泳類型:
1、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳:
在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時,DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關外,更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構象。在非變性條件下,DNA單鏈可自身折疊形成具有一定空間結構的構象,這種構象由DNA單鏈堿基決定,其穩(wěn)定性靠分子內(nèi)局部順序的相互作用(主要為氫鍵)來維持。相同長度的DNA單鏈其順序不同,甚至單個堿基不同,所形成的構象不同,電泳遷移率不同。
由于分子的空間結構影響,同等大小的DNA之間的電泳遷移率可相差10%。因此,不能用非變性聚丙烯胺凝膠電泳判斷DNA分子大小。
2、變性聚丙烯胺凝膠電泳:
(1)DNA變性:采用加熱、極端pH、有機溶劑、尿素或甲酰胺導致DNA解鏈。
?。?)凝膠中加入變性劑:5M的尿素,使DNA為單鏈線性,變性DNA的移動速度與其堿基組成和序列幾乎完全無關。
變性聚丙烯胺凝膠電泳可用于DNA序列分析等。
三、應用:
聚丙烯酰胺凝膠電泳適于分離小分子量蛋白質、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析,裝載的樣品量大,分辨率高,回收DNA純度高即能分離長度僅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子。
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